DNA:n rakennuspalikoiden mittaaminen on nyt helpompaa – tutkijat kehittivät uuden menetelmän

DNA eli deoksiribonukleiinihappo kantaa perinnöllistä tietoa solun tuman kromosomeissa ja mitokondrioissa. DNA on kahden pitkän vastakkaisen polynukleotidiketjun muodostama kaksoiskierre. Sen ketjut koostuvat neljästä fosfaattisidoksin toisiinsa kiinnittyneestä deoksiribonukleosidistä: deoksiadenosiinistä (dA), deoksitymidiinistä (dT), deoksisytidiinistä (dC) ja deoksiguanosiinistä (dG).

Kun DNA kahdentuu solunjakautumisen aikana tai sitä tarvitsee korjata, DNA-polymeraasientsyymi tuottaa uutta DNA-ketjua ja käyttää siihen deoksiribonukleosidien trifosfaatteja (dNTP) rakennuspalikoina. Synteesiin tarvittava energia tulee dNTP:iden fosfaattisidoksiin varautuneesta kemiallisesta energiasta.

Aikaisemmilla menetelmillä dNTP-pitoisuuksien mittaaminen on ollut haastavaa erityisesti sellaisista näytteistä, joissa on vain vähän DNA-synteesiä ja siten alhainen dNTP-pitoisuus. Nyt tutkijat ovat keksineet keinon, jolla dNTP-pitoisuuksia voidaan mitata entistä herkemmin esimerkiksi pienistä hiiren kudosnäytteistä.

Tutkimus on julkaistu Nucleic Acids Research -tiedelehdessä.

– Menetelmämme perustuu DNA-polymeraasiin ja muihin yleisesti molekyylibiologian laboratorioissa käytettäviin tarvikkeisiin. Menetelmään ei tarvitse erikoislaitteistoa tai radioaktiivisia aineita, kertoo dosentti Jukka Kallijärvi.

Mitokondriotautien tutkimuksessa on tarvetta herkälle mittausmenetelmälle

Mitokondriot ovat soluelimiä, jotka vastaavat soluhengityksestä, mutta niillä on myös paljon muita tehtäviä. Pyrimidiininukleosidien, kuten tymidiinin ja sytidiinin, valmistus on suoraan riippuvainen mitokondrioiden hengitysketjun toiminnasta. Mitokondriosairauksissa hengitysketjun toimintavajaus voikin aiheuttaa nukleotidien biosynteesin häiriötä ja niiden määrän muutoksia.

Nopeasti jakautuvissa soluissa, esimerkiksi luuytimessä ja syöpäkudoksessa, dNTP-pitoisuudet ovat suuria. Sen sijaan hitaasti tai ei ollenkaan jakautuvissa soluissa, esimerkiksi maksa- tai lihassoluissa, niiden määrä on hyvin alhainen. Kaikissa soluissa kuitenkin tarvitaan jonkin verran dNTP:itä DNA-vaurioiden korjausta ja mitokondrioiden DNA:n ylläpitoa varten.

GRACILE-mitokondriotautia sairastavilla potilailla ja sen hiirimallissa sairauden oireet ilmenevät muun muassa maksassa ja munuaisessa. Näissä kudoksissa on vain vähän jakautuvia soluja ja siten myös alhainen dNTP-pitoisuus.

– Ryhdyin mittamaan dNTP:iden määrää hiiren kudoksista ja huomasin pian, että aiemmin julkaistu menetelmä ei toiminut kudosnäytteillä, toteaa väitöskirjatutkija Janne Purhonen.

Ratkaisuna uusi herkempi määritysreaktio  

Tutkijoiden kehittämässä uudessa dNTP-mittausmenetelmässä tärkeitä innovaatioita olivat muun muassa näytteen epäpuhtauksia sietävän DNA-polymeraasin käyttö sekä herkän fluoresoivan värin hyödyntäminen.

Eräs tekninen haaste menetelmän kehityksessä oli kudoksessa jopa tuhansia kertoja runsaammista RNA:n rakenneosasista, ribonukleotideista, mahdollisesti tuleva häiriö. Menetelmää kehittänyt Purhonen oivalsi, että kun hän lisää mittausreaktioon toisen entsyymin, joka katkaisee polymeraasin tuottaman DNA-juosteen ribonukleotidin kohdalta, hän voi erottaa katkenneen juosteen oikeasta sen alemman sulamislämpötilan perusteella. Näin virheellisesti liittyneistä ribonukleotideista aiheutuva signaali saadaan poistettua.

Tutkimus tehtiin dosentti Jukka Kallijärven ja emeritaprofessori Vineta Fellmanin tutkimusryhmässä Folkhälsanin tutkimuskeskuksessa.

– Toivomme, että menetelmä osoittautuu hyödylliseksi mitokondriosairauksien tutkijoille ja muillekin biologian ja lääketieteen tutkijoille, Kallijärvi tiivistää.

Lisätietoja:

Dosentti Jukka Kallijärvi, Folkhälsanin tutkimuskeskus ja Kantasolujen ja aineenvaihdunnan tutkimusohjelma, Helsingin yliopisto
Puh. +358 50 448 7006
Sähköposti: jukka.kallijarvi@helsinki.fi

Viite: Janne Purhonen, Rishi Banerjee, Allison E McDonald, Vineta Fellman, Jukka Kallijärvi. A sensitive assay for dNTPs based on long synthetic oligonucleotides, EvaGreen dye, and inhibitor-resistant high-fidelity DNA polymerase. DOI: 10.1093/nar/gkaa516

**********************************

Ystävällisin terveisin

Elina Kirvesniemi, viestinnän asiantuntija, Helsingin yliopisto
elina.kirvesniemi@helsinki.fi, 050 409 6469